CFX Maestro——化繁为简的BIO-RAD定量PCR数据处理大师
上海柏辰生物科技有限公司   2019-04-04 02:06:38 作者:柏辰生物 来源: 文字大小:[][][]

                               

 

实时荧光定量PCR技术(Quantitative PCR, qPCR)已然是核酸分子定量检测的金标并得到普及,因此做好qPCR实验已成为当今分子生物学实验室必备技能之一。而目前市面上国内外定量PCR仪种类繁多,日趋同质化。作为qPCR技术的主要制造商之一的Bio-Rad公司更加关注qPCR技术的整体解决方案和用户的使用体验,于2017年推出了集qPCR数据收集处理、统计学分析和数据可视化于一体的CFX Maestro软件,实现了一站式的解决方案,使用户可轻松完成实验后期数据分析工作。

那么CFX系列qPCR仪+CFX Maestro 软件在科研实战中能否让人有耳目一新的体验呢?是时候展现真正的技术了。下面我们来看一篇来自美国休斯顿卫理公会医院的文献[1]

背景简介:

肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS),俗称“渐冻人”,是一种运动神经元疾病,病人表现出因上运动神经元和下运动神经元变性所致的肌无力、肌萎缩等症状。为研究其是否存在细胞自噬的病理,研究者将ALS患者和其他非ALS类型包括包涵体肌炎(inclusion body myositis,IBM,一种慢性炎症性肌病)样本等进行比较。观察ALS病理的一种已知标志物磷酸化TAR DNA结合蛋白43(pTDP-43)以及调节细胞自噬的P62蛋白的特异性表达情况。除用到免疫组化、免疫荧光的方法外,研究人员也对这两种蛋白对应的基因TARDBP SQSTM1 进行了qPCR实验分析比较,以下是具体的过程。

样本设置:

ALS样本组——ALS1-ALS5共5个生物学重复;

IBM样本组——IBM1-IBM3共3个生物学重复;

阴性对照组——MSC1-MSC3共3个轻微神经源性肌萎缩样本生物学重复;

空白对照——1个无模板对照

基因设置:


2个目的基因——TARDBP,SQSTM1;

2个参考基因——GAPDH,RPS18;

所用到的染料法引物对均来自于Bio-Rad提供的PrimePCR Assay。

板面布局:

12个样本×4个基因,1个96孔板做2个重复,共做2个96孔板(即2个批次实验,各4个技术学重复)。

数据分析方法:

 

TARDBP SQSTM1 表达用两个参考基因(GAPDH,RPS18)进行均一化,两组患者分别与对照组进行相对均一化基因表达比较,显著性检验采用非配对检验。

分析软件:


qPCR仪及分析软件:

Bio-Rad CFX96 Touch + CFX Maestro软件Mac版

实验结果:



 

上图qPCR结果显示,与非ALS、非IBM的阴性对照组相比,ALS和IBM患者的TARDBP SQSTM1 的mRNA水平均有所增加。ALS样本组相对于对照组,SQSTM1的表达量增加了4.21倍(SEM=0.54,P<0.0001),TARDBP 增加了1.67倍(SEM=0.31,= 0.0128)。IBM样本组相对于对照组, SQSTM1表达增加1.33倍(SEM=0.26,=0.012), TARDBP 表达增加1.31倍(SEM=0.29,P= 0.014)。证明ALS、IBM中均可能存在着细胞自噬的发病机制。

小编点评:


文中qPCR结果图清晰明了,一个完整的qPCR实验就这么轻松完成了。期间没有借助任何其他软件,从数据处理到结果导出全部由CFX Maestro软件一力承担,真正让qPCR实验化繁为简。下面让小编帮大家整理一下CFX Maestro软件在此研究中发挥的性能亮点:

  • 可以生物学组为单位计算相对基因表达,也可对单个样本进行计算;

  • 基因表达结果图形式多样,可自定义导出,支持简单注释、调整颜色及分辨率等功能,满足不同出版物的发表需求;

  • 统计分析无需导出数据至第三方软件,直接进行 检验,计算 值,同样支持方差分析;

  • 结果图中可直接出现“*”号指示统计学上表达差异显著的目标基因;

  • 支持多板数据合并分析,可设立板间对照消除实验批次差;

  • 整合PrimePCR assay,简化引物设计、实验设计和运行设置;

  • 既有用于PC平台的版本,也有用于Mac平台的版本可选。

最后,CFX Maestro软件的设计初衷是为了进一步规范qPCR实验流程,提高工作效率,降低出错率。Bio-Rad的科学家们将会根据用户的体验和反馈,不断完善CFX Maestro 软件统计学分析及作图功能,更多精彩,敬请期待。

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