实验技巧 | 多种样本来源的单细胞悬液制备方法
上海柏辰生物科技有限公司   2018-05-07 05:16:48 作者:市场部 来源:伯乐生命科学 文字大小:[][][]

农历年伊始,大家是否还沉浸在放假状态呢?实验手感生疏没?

Move on, move on, 导师喊你快开始科(ti)研(li)工作啦

 

 

 

做过流式的小伙伴们肯定清楚,想要流式的染色结果好,必须用单细胞悬液,细胞团和细胞碎片容易堵塞进样管。根据不同样本类型可选择不同的分散细胞的方法,以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。常用的组织来源样本的制备方法有酶消化法、机械法和化学处理法,这里就不赘述了。

 

下面小编给大家总结出从腹腔、骨髓、胸腺和脾脏样本经过酶消化法、机械法或化学处理法后获得单细胞悬液的一般程序,当然,实际操作时还是得注意可能需要视情况来稍作调整。


试剂

 磷酸盐缓冲液(BUF036A)含有1%牛血清白蛋白(PBS / BSA)

 氯化铵裂解缓冲液:0.16M氯化铵,0.17M Tris,pH7.2

 25µg/ ml DNAse I  PBS / BSA或5 mM EDTA


操作步骤

1. 保持细胞在冰上以减少细胞死亡(该步骤会导致细胞聚集), 加入DNAse I或EDTA可以减少细胞聚集。采用孔径40um的细胞过滤器来去除细胞团和细胞碎片

2.  4℃,300-400g离心5min

3. 弃去上清,用10ml氯化铵裂解缓冲液重悬沉淀

4. 混匀后在4℃孵育2min,注意:切忌超时!

5.  4℃,300-400g离心5min

6. 弃去上清,用10ml预冷的PBS / BSA(4℃)重悬沉淀

7. 重复步骤5、6,最后得到10ml的PBS/BSA(4℃)细胞悬液

8. 细胞计数,可使用TC20细胞自动计数仪来进行(Bio-Rad, #1450102)

9. 细胞浓度最终调整为0.7 - 1.2×107/ml


最佳提醒

流式细胞术实验应考虑以下几点:

a、为避免非特异性结合,需要用Fc受体阻断试剂(Bio-Rad, Seroblock试剂BUF041)阻断具有FcR的细胞,如脾脏细胞;

b、使用合适的对照:同种型对 照—用于确定是否存在非特异性染色;未染色的空白对照—监测细胞是否有自发荧光;

c、多色流式细胞术实验中,需使用补偿调节管(调节荧光补偿)和FMO管(帮助识别门控边界)。

 

 

文中产品仅用于科研用途,不用于临床诊断

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