DNA提取那点事儿
上海柏辰生物科技有限公司   2018-07-04 07:51:05 作者:柏辰生物 来源:医生象 文字大小:[][][]

核酸(nucleicacid)在生物界中堪称主宰,是一类非常重要的生物大分子,它在生物的繁衍、发育、维持、衰老和死亡等一切生命活动中扮演着重要的角色,如果其结构出现稍许的变动,比如一个碱基的差错、缺失或增加,就有可能导致突变、缺陷或疾病的出现,所以核酸已成为生物化学、遗传学以及其他有关生命学科的热门研究课题,其覆盖面之广、进展之速为其他学科所望尘莫及。

                          

而进行核酸研究的第一个前提就是能够将核酸从众多纷繁复杂的生物大分子中提取出来,并纯化到一定程度,以便进行相应的科学研究和实际应用。和大家共同分享一下核酸提取样品制备、提取方法及检测方面的知识,以期能够对大家的科研有所帮助。

 

DNA是什么?

脱氧核糖核酸(缩写为DNA),是一种生物大分子,是以4种脱氧核苷酸为单位连接而成的长链,这4种脱氧核苷酸分别含有A,T,C,G四种碱基。主要功能是贮存决定物种的所有蛋白质和RNA结构的全部遗传信息;策划生物有次序地合成细胞和组织组分的时间和空间;确定生物生命周期自始至终的活性和确定生物的个性。

                           

DNA有哪些种类?

染色体DNA

原核生物和真核生物均含有染色体DNA,基因组大小物种间差异较大。

            

 

线粒体DNA

这是真核生物特有的染色体外遗传物质,含有与呼吸作用相关的基因。已知的是哺乳动物的线粒体基因组最小(如人的线粒体16.5kb左右)果蝇和蛙的稍大,酵母的更大,而植物的线粒体基因组最大(最小的为100kb左右)。

 

叶绿体DNA

这是真核生物特有的染色体外遗传物质,含有与光合作用相关的基因。高等植物叶绿体的DNA为双链共价闭合环状分子,其长度随生物种类而不同,其大小在120kb~217kb之间。

 

质粒DNA

质粒(Plasmid)是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于核区DNA而自主复制的共价、闭合、环状双链DNA分子,其大小通常在1~100Kb范围内。

 

病毒&噬菌体DNA

活细胞内专性寄生,基因组相差较大,如乙肝病毒DNA只有3kb大小,T4噬菌体的基因组约165kb。

 

 

DNA提取的原则

  • 保证DNA一级结构的完整性;
  • 提取的DNA样品中不应存在对酶存在抑制作用的有机溶剂及过高浓度的金属离子;
  • 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度;
  • 排除其它核酸分子(RNA)的污染。
  •  

常用基因组DNA提取方法

 

一、CTAB法

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子型表面活性剂,可溶解细胞膜使细胞裂解。在高盐溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB可与蛋白质和中性多糖形成复合物而沉淀,不能沉淀核酸和酸性多糖,另外它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

CTAB法是植物基因组DNA最经典的提取方法。

 

CTAB裂解液组份及各组份的作用

    
  1. Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
  2. EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
  3. NaCl提供一个高盐环境,使DNA充分溶解于液相中;
  4. CTAB裂解细胞,沉淀蛋白和中性多糖;
  5. PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它对多糖的去除也有一定的作用;
  6. β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除;
  7. 蛋白酶K用于生物样品中蛋白质的一般降解,将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子分离出来。

 

 

抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?

 

酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水互不相溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。

 

 

为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戊醇?

 

在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊醇为24:1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加一份24:1的氯仿与异戊醇即成),同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

 

 

乙醇沉淀和异丙醇沉淀各有哪些优缺点?

 

1、异丙醇

优点:所需体积小且速度快,适用于浓度低,而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子RNA;但对多糖产物不产生沉淀,一般不需要在低温条件下长时间放置;

缺点:易使盐类(如NaCl、蔗糖)与DNA共沉淀;在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去,所以常规需要用70%的乙醇漂洗DNA沉淀数次。

 

2、乙醇

优点:对盐类沉淀少,DNA沉淀中所含的痕量乙醇易蒸发出去,不影响后续的实验;

缺点:是总体积较大,在适当的盐浓度下,2倍样品体积的95%乙醇可有效沉淀DNA需在-20度放置较长时间(30分钟-1小时)同样需要70%乙醇洗涤。

 

 

富含多糖多酚植物高质量基因组DNA提取的难点

 

多酚类物质极易被氧化成褐色物质醌类,醌能够形成游离的自由基,这种自由基能够引起磷酸二酯键的断裂,造成基因组DNA完整性的破坏以及序列长度的降低;多糖、单宁等物质和DNA的理化性质接近,容易和核酸共沉淀而与DNA结合成粘稠的胶状物,影响了DNA的质量和纯度,不能被限制性内切酶酶切,严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。

 

 

二、CTAB+过柱法

 

核酸纯化柱(Spincolumn)可以用于各种材料的DNA\RNA的提取以及精制。具有操作简单、回收率高、性能稳定等特点,目前产品已经为国内外大多数实验室和公司使用。核酸纯化柱(Spincolumn)采用硅胶膜作为核酸的特异性吸附材料,而对其他生物材料基本不吸附,可以保障最大程度地回收样品中的DNA\RNA,同时去除其他杂质。对于杂质组份不清楚,杂质含量较多的样品,可考虑采用CTAB裂解,然后过柱纯化的方式进行提取,一般可显著改善提取样品的纯度。

                                                                 

 

三、SDS法

SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子型表面活性剂,可使细胞膜崩解,与膜蛋白疏水部分结合并使其与膜分离,高浓度的SDS还可以破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键,甚至改变蛋白质的构象。SDS法适用于动物组织、血液、细胞、细菌和酵母等DNA的提取。

 

SDS裂解液组份及各组份的作用

 

 

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