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关于《EGFR-TKIs耐药后应对策略及标准化质量控制中国专家共识》的数字PCR解决方案

肺癌是我国发病率和死亡率均位居首位的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占80%～85%，包括肺鳞癌、肺腺癌等。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突变是NSCLC中最常见的驱动基因突变,尤其在亚洲NSCLC人群(30%～50%)、肺腺癌(40%～60%)中多见。EGFR突变主要发生在第18～21号外显子上酪氨酸激酶区域，最常见的经典突变为EGFR外显子19缺失（约占45%）和外显子21中的L858R点突变（约占40%）。随着精准医学的发展，EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)已成为EGFR突变晚期NSCLC患者的标准治疗选择。目前EGFR-TKIs分为第一、二代和第三代，其中约50%～60%的患者在第一、二代EGFR-TKIs一线治疗后出现T790M耐药突变。第三代EGFR-TKIs因具有克服该耐药突变的能力，可作为第一、二代EGFR-TKIs一线治疗进展后的二线治疗，同时也凭借多项Ⅲ期随机对照研究的阳性成果，成为当前EGFR突变肺癌的标准一线治疗。虽然EGFR-TKIs显著提升了EGFR突变晚期NSCLC的无进展生存时间(progression-free survival，PFS)和总生存时间(overall survival，OS)，但仍无法避免出现疾病进展。因此，EGFR-TKIs耐药问题成为临床治疗的主要挑战之一。

图片来源：《中国肿瘤临床与康复杂志》

共识第二部分：EGFR-TKIs治疗耐药的辅助判断及免疫微环境特征

该部分第三点提及分子病理学检测对于EGFR-TKIs耐药患者建议二次组织活检并进行耐药基因检测。常用的分子诊断检测技术包括但不限于免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、微滴式数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)、Sanger测序和下一代高通量测序(next-generation sequencing，NGS)技术等。

（1）EGFR T790M检测：对于第一、二代EGFR-TKIs耐药后无法获取组织的患者，可从外周血或胸、腹腔积液中提取循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)进行EGFR T790M检测。当ctDNA阴性时，仍应建议患者行组织检测以明确EGFR T790M突变状态。

（2）EGFR、间质上皮细胞转化因子(mesenchymal-epithelial transition factor，MET)等多基因检测：经济成本可接受的情况下，建议对EGFR-TKIs耐药后的患者进行多基因检测。NGS或RT-PCR多基因联合检测可同时对多个靶点基因的突变、扩增和重排进行检测，NGS测序尤其在鉴别EGFR C797S/T790M顺式及反式突变构象等方面更具优势。T790M/C797S顺式突变为2个基因突变位于同一条DNA链上，而T790M/C797S反式突变为2个基因突变位于不同的DNA链上。可以使用1种或多种方法联合进行广谱分子检测，包括但不限于间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)重排、c-ros肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(ROS proto-oncogene 1, receptor tyrosine kinase，ROS1)融合、转染重排基因(rearranged during transfection，RET)重排、鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sar-coma viral oncogene homolog B1，BRAF)基因突变、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS)突变、神经营养因子受体酪氨酸激酶1/2/3(neurotrophic receptor tyrosine kinase 1/2/3，NTRK1/2/3)基因融合、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA)突变、MET扩增或过表达、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)突变或扩增等，以识别耐药机制。

FISH是MET扩增检测的金标准，但当前MET扩增检测存在两大挑战：

①缺乏统一临界值，有专家共识推荐判断标准为MET拷贝数≥5或MET/CEP7≥2，而塞普替尼获批的SACHI Ⅲ期研究设定了差异化阈值，对于第一、二代EGFR-TKIs一线治疗耐药后MET扩增定义为MET拷贝数≥5或MET/CEP7≥2，对于第三代EGFR-TKIs一线治疗耐药后MET扩增定义为MET拷贝数≥10；

②NGS检测虽与FISH有较好的一致性，但由于不同实验室可能使用不同的NGS平台和生物信息学分析策略，MET扩增的临界值不同，检测结果的呈现方式也可能有所不同。

在EGFR-TKIs治疗过程中，动态监测ctDNA变化可早于影像学及血清学肿瘤标志物识别EGFR突变，绘制肿瘤的基因组图谱，并提供有关耐药突变出现的实时动态信息，有助于临床及时调整治疗方案。

共识推荐1：患者服用EGFR-TKIs期间，建议定期做常规复查，进行颈胸腹部（包括肾上腺）增强或平扫CT（颈部淋巴结及腹部检查可考虑超声），如有症状恶化随时复查。随访频率可根据治疗阶段和临床情况调整。目前随访方案主要基于临床经验，未来需更多循证依据优化。（证据级别：V类；推荐级别：强推荐）

共识推荐2：对于EGFR-TKIs耐药的患者，推荐二次活检和基因检测。若组织标本不可及，可考虑液体活检。根据基因检测结果，识别耐药机制，及时调整方案。（证据级别：Ⅰ类；推荐级别：强推荐）

数字PCR以其高灵敏度、绝对定量的显著特色，在肿瘤伴随诊断领域发挥日益重要的作用。随着平台通量的迭代提升，利用数字PCR亦可进行多位点的高通量检测，对临床辅助诊断提供重要依据。

产品

介绍

人EGFR基因突变检测试剂盒（多重ddPCR法）

货号：BP-EGFR-2025；规格：24人份

本品适用于伯乐QX600微滴式数字PCR，以DNA为模板的EGFR基因突变检测。本品包含1管BCY Digital PCR Supermix(no dUTP)浓度为2 ×，4管引物探针混合液，分别是ddPCR Assay for EGFR 19del/L858R、ddPCR Assay for EGFR G719X/20ins-1、ddPCR Assay for EGFR L861Q/S768I、ddPCR Assay for EGFR T790M/20ins-2，每管引物探针分孔使用。各反应孔检测位点及荧光标记具体见下表1。配制数字PCR反应体系时，模板与本品试剂混合后即可。反应体系特异性好，灵敏度高。

表1 各反应孔检测位点及荧光标记

20ins-1（D770_N771insG、H773_V774insNPH、N771_H773dup）

20ins-2（V769_D770insASV、D770_N771insSVD）

反应体系灵敏度可达0.5%，结果图展示如下：

反应孔1

19del

L858R

反应孔2

G719X

20ins-1

反应孔3

L861Q

S768I

反应孔4

T790M

20ins-2

服务

介绍

人EGFR基因T790M-C797S顺反式检测

三代肺癌靶向药物治疗产生耐药的患者，可通过上海柏辰生物T790M-C797S顺反式检测体系进行检测，该检测体系能检测患者是否具有T790M和C797S突变，并且能定位两种突变位点的排列方式（顺式或反式）。且上海柏辰生物自主开发的“T790MC797S顺反式”小程序可轻松判读QX200下机数据T790M-C797S的顺式/反式突变，进而辅助临床治疗策略制定。

T790M-C797S顺式、反式结果图示

微信搜索小程序“顺反式”

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产品

介绍

人BRAF基因V600E位点突变检测试剂盒(ddPCR)

货号：BP-BV600024；规格：24人份

本品适用于微滴式数字PCR，以DNA为模板的BRAF基因V600E突变位点检测。本品包含1管BCY Digital PCR Supermix(no dUTP)浓度为2 ×,1管引物探针混合液ddPCR Assay for BRAF V600E，其中野生型探针HEX标记，突变型探针FAM标记。配制数字PCR反应体系时，模板与本品试剂混合后即可。反应体系特异性好，灵敏度高，线性相关性良好。

LoQ=0.5%、LoD=0.1%，线性结果图展示

产品

介绍

TERT基因C228T/C250T突变位点检测试剂盒

货号：BP-TC22801/BP-TC25001；规格：20人份

由上海柏创翌生物自主研发的科研试剂TERT启动子C228T和C250T突变检测试剂盒（ddPCR法），获CE-ROHS认证，该认证对本试剂盒进行了几十种有害物质分析检测，确保其含量低于规定的阈值，以保护人体健康及环境。

人TERT基因C228T/C250T突变位点检测试剂盒，适用于微滴式数字PCR，以DNA为模板的TERT基因C228T/C250T突变位点检测。本品包含BCY Digital PCR Supermix(no dUTP)浓度为2 ×,以及引物探针混合液ddPCR Assay for TERT C228T/C250T，其中野生型探针HEX标记，突变型探针FAM标记。配制数字PCR反应体系时，仅需将模板与本品试剂混合后即可。

产品

介绍

人KRAS基因突变检测试剂盒（七类型）

货号：BP-KG121301；规格：24人份

本品适用于微滴式数字PCR，以DNA为模板的KRAS基因7种(G12A、G12C、G12D、G12R、G12V、G12S、G13D)突变位点检测。本品包含BCY Digital PCR Supermix(no dUTP)浓度为2 ×，引物探针混合液ddPCR Assay for KRAS mutations、ddPCR Assay for KRAS WT，其中野生型探针HEX标记，突变型探针FAM标记。配制数字PCR反应体系时，仅需将模板与本品试剂混合后即可。本品适用于KRAS突变阴阳性的筛查，一孔反应可检测7种突变类型，不区分具体位点。

结果示意：

阳性样本

阴性样本

服务

介绍

人PIK3CA基因突变检测

本检测利用微滴式数字PCR技术结合荧光探针技术，对PIK3CA基因突变进行检测。

结果示意：

阳性样本(E542K)

阳性样本(E545K)

阳性样本(H1047L)

阳性样本(H1047R)

产品

介绍

人ERBB2基因拷贝数变异检测试剂盒(ddPCR)

货号：BP-ERBB2-2019；规格：24人份

本品适用于微滴式数字PCR，以DNA为模板的ERBB2基因拷贝数变异检测。本品包含BCY Digital PCR Supermix(no dUTP)浓度为2 ×，以及引物探针混合液ddPCR Assay for ERBB2，ddPCR Assay for EIF2C1其中目的基因ERBB2探针FAM标记,内参基因EIF2C1探针HEX标记。配制数字PCR反应体系时，仅需将模板与本品试剂混合后即可。

结果示意：