揭秘WB | 蛋白电泳总翻车？先搞懂蛋白质分离的秘密

Western Blot——蛋白电泳

做Western Blot实验的你，是否也遇到过这样的窘境：样品制备小心翼翼做到位，最终条带却模糊不清、拖尾严重，甚至目标蛋白“跑丢”了？问题很可能出现在电泳环节！上一篇我们已经成功解锁样品制备，从细胞组织中提取、定量目标蛋白，得到状态稳定的蛋白样品，但此时它们仍像一群杂乱无章的“小家伙”，挤在样品孔里难分彼此。而电泳，就是给这群“小家伙”精准“排兵布阵”的关键一步。电泳的每一个细节都直接影响后续条带质量，甚至决定实验成败。今天我们就聚焦常用的几种电泳方法，带你摸清蛋白分离的底层逻辑。

蛋白质电泳迁移影响因素

在蛋白电泳过程中，蛋白质在电场作用下迁移，穿过由水性聚合物（如聚丙烯酰胺）构成的凝胶基质中的孔隙。凝胶的孔径大小对蛋白质的迁移行为具有显著影响。总体来说，蛋白质在凝胶电泳中的迁移速率主要受以下因素影响：

· 凝胶浓度（聚合物质量百分比）：决定孔径大小；

· 电场强度：影响迁移速度；

· 温度：过高容易导致条带变形或凝胶熔化；

· 蛋白质自身的理化特性：包括大小、形状和电荷，其中电荷又受缓冲液PH、离子强度以及是否添加变性剂（如SDS）或还原剂（如β-巯基乙醇）等因素调控。

聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)

绝大多数蛋白质分离方法均采用水性聚丙烯酰胺凝胶作为分子筛，该技术也因此得名——聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。在电场作用下，蛋白质迁移通过凝胶网络，其孔径结构对不同大小的分子产生产生筛分效应：小分子蛋白迁移较快，大分子则较慢，从而实现基于分子量的物理分离。

典型的PAGE装置中，凝胶夹置于上下两个缓冲液室之间，电场仅能通过凝胶形成通路。凝胶通常垂直放置（故称垂直电泳），浇注时插入梳子以形成加样孔。施加电压后，带负电的蛋白质从上样孔进入凝胶并向阳极迁移。为便于监测进程，样品中常加入示踪染料（如溴酚蓝），其在凝胶中的前沿位置可直观反应电泳进度。若电泳时间过长，目标蛋白可能迁移出凝胶底部，导致信号丢失。

聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质电泳分离示意图

非变性凝胶电泳(Native-PAGE)

非变性PAGE(Native PAGE)是一种在不含变性剂（如SDS）和还原剂（如β-巯基乙醇）的条件下进行的蛋白质电泳技术，样品通常使用非还原性、非变性缓冲液制备。在此条件下，蛋白质维持其天然构象、电荷状态及亚基间相互作用。因此，其迁移行为不仅取决于分子大小，还受固有电荷、形状以及是否形成多亚基复合物等多重因素影响。

由于保留了天然净电荷，不同蛋白质可能朝向不同电极迁移（通常在碱性PH下整体带负电而向阳极移动），且复合物的迁移模式往往难以预测。这种方法适用于研究蛋白质的天然状态、寡聚化形式及其相互作用。

变性凝胶电泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE是一种常用的电泳方法，该技术将去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)加入缓冲液中。在SDS与变性剂（如还原剂）的共同作用下，蛋白质的二硫键被打开，并完全解聚为多肽链。此外，SDS通过非共价方式与蛋白质结合，赋予其一系列有利于电泳分离的新特性：