百年家禽顶刊发文｜齐碳纳米孔测序助力新疆农大完整解析蛋鸡 mcr-8.2 耐药质粒

肺炎克雷伯菌是人兽共患条件致病菌，广泛定植于家禽肠道，可通过食物链传播至人类，多重耐药菌株尤其是携带质粒介导粘菌素耐药mcr基因菌株，会直接导致临床 “最后一道防线” 粘菌素失效，构成重大公共卫生隐患。

1. 区域监测空白：国内东部家禽耐药菌监测体系完善，但新疆规模化蛋鸡场肺炎克雷伯菌流行、分子耐药特征缺乏系统性数据；

2. mcr-8.2传播风险突出：mcr-8.2可通过接合质粒跨菌、跨宿主传播，全球多地人、禽、环境样本均有检出，高风险 ST147 克隆常引发院内感染；

3. 短读长测序局限：二代短读长测序无法完整拼接大型 IncFII 耐药质粒，难以解析插入序列、耐药基因簇完整遗传环境，亟需长读长测序补齐技术短板；

4. 国产纳米孔测序落地畜牧病原领域：齐碳 QNome 纳米孔平台凭借超长读长、实时测序、低成本优势，适配畜禽大规模耐药菌全基因组完整图谱解析，填补国产三代测序在兽医耐药基因组学的应用案例缺口。

图1  本研究在中国新疆的样本采集点

研究团队采集新疆五家渠、昌吉、喀什、塔城、巴音郭楞 5 个地区 6 家蛋鸡场 1115 份鸡粪便，分离 408 株肺炎克雷伯菌，总分离率 36.6%，塔城地区分离率最高达 57.3%；菌株粘菌素耐药率 55.0%、氟苯尼考耐药率 50%，多重耐药菌株占比 28.9%，9.8% 菌株产 ESBL 超广谱 β 内酰胺酶，塔城产 ESBL 菌株检出率高达 26.2%，仅 2 株碳青霉烯耐药菌株，未检出blaNDM碳青霉烯耐药基因。 全样本 PCR 筛查 24 类耐药基因，blaSHV、oqxA检出率均为 97.8%，成为新疆蛋鸡源菌株核心耐药标记；mcr基因整体检出率仅 0.5%，最终筛选获得 2 株mcr-8.2阳性菌株 CD19（ST147 高风险克隆）、CX36（ST3410）。

图2 （A）肺炎克雷伯菌抗菌药物耐药谱；（B）肺炎克雷伯菌多重耐药分布情况

研究采用 Illumina 短读长 + 齐碳纳米孔长读长联合测序策略，依靠 QNome 平台超长读长优势，组装获得全长完整基因组与 95kb IncFII 型接合质粒 pCD19-mcr8，解决二代测序无法拼接大型耐药质粒的痛点：

• 精准定位 mcr-8.2 完整遗传骨架：明确保守核心元件IS903B-dgkA-baeS-copR-ISEcl1-mcr-8.2-ISKpn26，完整还原介导耐药基因水平转移的插入序列排布；

• 质粒同源性比对：pCD19-mcr8 与全球鸡源、人源、环境源mcr-8.2阳性质粒骨架高度保守，同源一致性最高达 99.98%，证实该类质粒具备跨宿主、跨地域传播潜力；

图 5 两株mcr-8.2阳性菌株的质粒图谱。该图谱展示了两株菌株各自质粒的结构特征，包含各类基因区段及其携带的耐药基因。

图6 质粒环形比对图谱及mcr-8.2基因遗传环境。(A) 质粒 pCD19-mcr8 与 NCBI 数据库中鸡源、人源、环境源其他质粒的环形比对；最外圈以mcr-8.2阳性质粒 pCD19-mcr8 作为参考质粒。(B) 质粒 pCD19-mcr8 与 NCBI 数据库中鸡源、人源、环境源其他质粒携带mcr-8.2基因片段的比对分析。

基于齐碳纳米孔测序获得的完整质粒信息开展功能验证：

• 接合试验证明 pCD19-mcr8 可稳定转移至大肠杆菌 C600，实现跨物种耐药基因传播；

• 生长曲线、72h 竞争力试验显示，携带质粒的接合子与空载菌株生长速率无统计学差异（p＞0.05），说明mcr-8.2阳性质粒不会给宿主带来生存负担，无抗生素选择压力下仍可长期稳定留存，大幅提升耐药菌防控难度。

图7 质粒 pCD19-mcr8 对菌株 C600 造成的适应性代价分析。(A) 受体菌 C600 与携带 pCD19-mcr8 质粒的接合子 CD19C 生长曲线对比；(B) 携带 pCD19-mcr8 质粒的接合子 CD19C 相对适合度检测结果。

依托齐碳长读长组装高质量完整基因组，构建全球 51 株mcr-8.2阳性菌株核心基因组进化树：

• 全球mcr-8.2菌株以人源为主，中国分离株数量最多，本研究 ST147 菌株与澳洲、泰国人源菌株存在大量 SNP 差异，不属于近期传播簇，但证实高风险克隆跨洲际传播潜力；

图4 51 株mcr-8.2阳性肺炎克雷伯菌系统发育分析。菌株包含本研究分离得到的 2 株菌株，以及从 NCBI 数据库下载的 49 株不同宿主、不同地域来源的基因组草图。紫色、品红色、浅绿色圆环分别代表不同菌株来源；红色、蓝色、浅紫色、橙色、黄色、棕色、粉色矩形用于区分菌株分离的不同国家。

1. 新疆 5 个地区蛋鸡源肺炎克雷伯菌对 9 种受试抗菌药物的多重耐药率达 28.9%，β- 内酰胺类、质粒介导喹诺酮类耐药基因检出率均高达 97.8%，产超广谱 β- 内酰胺酶菌株检出率为 9.8%。本研究为国内首次在新疆蛋鸡中检出mcr-8.2阳性肺炎克雷伯菌。

2. 质粒在mcr-8.2基因传播中起到关键作用，携带mcr-8.2的 IncFII 型质粒可自主接合转移，且不会造成宿主菌适应性下降。该质粒与鸡源、人源、环境源菌株的同源质粒高度相似，提示耐药基因可通过食物链向人类传播，亟需建立常态化畜禽耐药基因组监测；

3. 可移动遗传元件极大推动了粘菌素耐药性的跨宿主传播。针对家禽养殖领域mcr基因的出现，需建立长期常态化监测体系；同时依托 “同一健康” 框架，整合动物、环境、人群监测数据，科学制定畜禽养殖抗菌药物使用规范，阻断耐药菌与耐药基因的传播链条。

4. 本研究为国内首次利用国产纳米孔测序完成新疆蛋鸡源mcr-8.2阳性 ST147 高风险克隆完整基因组解析，QNome 纳米孔长读长测序是完整解析畜禽耐药质粒、可移动遗传元件的核心技术之一，超长读长可一次性拼接大型 IncFII 接合质粒，精准解析耐药基因完整遗传环境，弥补二代短读长测序组装碎片化缺陷；验证了齐碳纳米孔平台在兽医微生物、食源性耐药菌全基因组研究中的稳定应用能力，为全国畜牧领域耐药菌监测提供国产化测序解决方案参考。