CFX Maestro——化繁为简的BIO-RAD定量PCR数据处理大师

来源: | 作者: | 发布时间: 2019-04-04 | 664 次浏览 | 分享到:

实时荧光定量PCR技术（Quantitative PCR, qPCR）已然是核酸分子定量检测的金标并得到普及，因此做好qPCR实验已成为当今分子生物学实验室必备技能之一。而目前市面上国内外定量PCR仪种类繁多，日趋同质化。作为qPCR技术的主要制造商之一的Bio-Rad公司更加关注qPCR技术的整体解决方案和用户的使用体验，于2017年推出了集qPCR数据收集处理、统计学分析和数据可视化于一体的CFX Maestro软件，实现了一站式的解决方案，使用户可轻松完成实验后期数据分析工作。

那么CFX系列qPCR仪+CFX Maestro 软件在科研实战中能否让人有耳目一新的体验呢？是时候展现真正的技术了。下面我们来看一篇来自美国休斯顿卫理公会医院的文献^[1]。

背景简介：

肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），俗称“渐冻人”，是一种运动神经元疾病，病人表现出因上运动神经元和下运动神经元变性所致的肌无力、肌萎缩等症状。为研究其是否存在细胞自噬的病理，研究者将ALS患者和其他非ALS类型包括包涵体肌炎（inclusion body myositis，IBM，一种慢性炎症性肌病）样本等进行比较。观察ALS病理的一种已知标志物磷酸化TAR DNA结合蛋白43（pTDP-43）以及调节细胞自噬的P62蛋白的特异性表达情况。除用到免疫组化、免疫荧光的方法外，研究人员也对这两种蛋白对应的基因TARDBP 和SQSTM1 进行了qPCR实验分析比较，以下是具体的过程。

样本设置：

ALS样本组——ALS1-ALS5共5个生物学重复；

IBM样本组——IBM1-IBM3共3个生物学重复；

阴性对照组——MSC1-MSC3共3个轻微神经源性肌萎缩样本生物学重复；

空白对照——1个无模板对照

基因设置：

2个目的基因——TARDBP，SQSTM1；

2个参考基因——GAPDH，RPS18；

所用到的染料法引物对均来自于Bio-Rad提供的PrimePCR Assay。

板面布局：

12个样本×4个基因，1个96孔板做2个重复，共做2个96孔板（即2个批次实验，各4个技术学重复）。

数据分析方法：

将TARDBP 和SQSTM1 表达用两个参考基因（GAPDH，RPS18）进行均一化，两组患者分别与对照组进行相对均一化基因表达比较，显著性检验采用非配对t 检验。

分析软件：

qPCR仪及分析软件：

Bio-Rad CFX96 Touch + CFX Maestro软件Mac版

实验结果：

上图qPCR结果显示，与非ALS、非IBM的阴性对照组相比，ALS和IBM患者的TARDBP 和SQSTM1 的mRNA水平均有所增加。ALS样本组相对于对照组，SQSTM1的表达量增加了4.21倍（SEM=0.54，P<0.0001），TARDBP 增加了1.67倍（SEM=0.31，P = 0.0128）。IBM样本组相对于对照组， SQSTM1表达增加1.33倍（SEM=0.26，P =0.012）， TARDBP 表达增加1.31倍（SEM=0.29，P= 0.014）。证明ALS、IBM中均可能存在着细胞自噬的发病机制。