微滴式数字PCR（ddPCR®）以其优异的灵敏度，准确性和重复性受到全球科研人员喜爱。ddPCR®经典重温系列，正是带您重访那些奠定技术基石的里程碑研究——2011年发表在《Analytical Chemistry》杂志的文章，不仅详细介绍了ddPCR®技术的原理，工作流程，还将这项当时突破性的技术进行了应用拓展。通过三个实验案例CNV，稀有突变和绝对定量实验凸显了ddPCR®技术超高的分辨率和灵敏度。
研究通过ddPCR®技术对7例HapMap样本的3个目标基因（MRGPRX1、CYP2D6及X染色体）进行拷贝数变异（CNV）分析。实验采用双探针体系（目标基因FAM标记/参考基因RPP30 VIC标记），实现单孔同步检测与内标校准。结果显示：
1.MRGPRX1基因：单孔检测即可精准区分1~6拷贝的连续变异状态（图a），突破传统qPCR对多拷贝基因的分辨极限；
2.CYP2D6与X染色体：低拷贝数（1-3）变异亦呈现清晰聚类，证实技术对基因组微缺失/微重复的检测效能；
3.CCL3L1基因（HIV易感关联）：在13例HapMap样本中，ddPCR®技术测得NA18507样本拷贝数为6.05，而NGS仅报告5.7（图b）。值得注意的是，NGS因全基因组分散覆盖导致靶基因区域平均测序深度仅30×，而ddPCR®技术通过靶向富集策略，单孔即可实现双基因20,000×检测通量——这一数量级差异解释了二者在分辨率上的显著差距。
这一案例凸显了ddPCR®技术在靶向高精度定量中的独特优势：其通过超高通量分区（单孔20,000微滴）与统计学模型，将检测灵敏度提升至单个分子水平，为复杂CNV的临床研究提供了可扩展的技术平台。
通过微滴式数字PCR（ddPCR®方法）确定拷贝数变异状态。（a）在HapMap样本中对MRGPRX1、X染色体、CYP2D6和（b）CCL3L1基因的拷贝数变异状态进行测量。（c）在正常和肿瘤乳腺组织中提取的DNA中，GRB7和ERBB2基因拷贝数变化的相关性。每个标记代表来自单个ddPCR®孔（约20,000个微滴）的拷贝数变异（CNV）测量结果。误差条表示每个拷贝数测定的泊松95%置信区间。
通过体系优化，实时定量PCR（qPCR）对突变等位基因的检测下限可达1%。而基于相同TaqMan探针体系，微滴数字PCR（ddPCR®技术）通过物理分区策略实现了技术性能的跃升：其将目标突变DNA从高达10^5倍的同源野生型背景中分离，使突变/野生型有效富集倍数提升2万倍。
理论模型表明，突变分子的富集效率与反应体系的分区数呈正相关——单个样本的2万微滴分区使每个反应单元的竞争性扩增干扰降至可忽略水平。
以BRAF V600E突变为例，双探针TaqMan检测验证了该技术的超敏特性：在野生型DNA绝对优势（突变频率0.001%）的极端条件下，ddPCR®技术仍能稳定检出突变信号，灵敏度较qPCR提升三个数量级。
值得注意的是，该技术可通过增加样本投入量（经限制性酶切预处理降低粘度）进一步突破检测极限，为临床痕量样本（如循环肿瘤DNA、胎儿游离DNA）分析提供解决方案。
此项突破性进展标志着分子诊断进入"万分之一"灵敏度时代：研究者得以在单碱基分辨率下解析<0.01%的稀有突变，为微小残留病（MRD）监控、无创产前诊断（NIPT）及肿瘤早筛等场景开辟精准量化新途径。
通过ddPCR®系统检测在同源野生型DNA背景下BRAF V600E稀有突变等位基因。将突变细胞系DNA进行系列稀释，置于恒定的野生型人类基因组DNA背景中。微滴分区减少了竞争性扩增效应，使得检测限可低至0.001%的突变比例，比实时定量PCR（qPCR）提高了1000倍。该突变细胞系中BRAF V600E的含量为35%，由ddPCR®技术测量得出。
通过ddPCR®技术对19例孕10-20周孕妇血浆中的胎儿游离DNA进行绝对定量。针对cfDNA片段化、低丰度的特性，采用双策略检测体系：基于SRY基因标记男性胎儿DNA，同时利用甲基化酶切（HhaI/HpaII）选择性保留胎儿高甲基化RASSF1基因，结合管家基因（β-actin）实现总DNA定量。
结果显示，胎儿DNA占比（胎儿负荷）为2.1%-11.9%，其中男性样本的甲基化RASSF1与SRY定量结果高度相关（R²=0.937），验证了女性胎儿检测的可靠性。相较于NGS技术（全基因组平均深度30×），微滴式数字PCR通过单孔2万次检测事件实现靶向超高灵敏度，在CCL3L1基因拷贝数分析中分辨率优于NGS（6.05 vs. 5.7拷贝）。该技术突破性别依赖限制，为无创产前诊断提供普适性解决方案，并推动液体活检向更早孕周及肿瘤早筛领域拓展。
对男性和女性胎儿的无细胞血浆中循环胎儿和母体DNA的绝对定量。
(a) 使用SRY（红色条）和高甲基化RASSF1（蓝色条）定量胎儿DNA浓度。胎儿DNA的RASSF1基因高甲基化，而母体DNA低甲基化。通过甲基化敏感限制酶选择性消化低甲基化部分，保留高甲基化的胎儿DNA用于定量。
(b) 总DNA浓度（黑色条）为六次独立检测的加权平均值，包括未消化的RASSF1、β-肌动蛋白、RNaseP和TERT。
(c) 胎儿负荷通过SRY/总DNA（仅男性胎儿）和RASSF1/总DNA（男性和女性胎儿）比值计算。男性胎儿中，SRY与RASSF1胎儿负荷的相关系数为97.3%。由于胎儿DNA并非完全高甲基化，部分样本的RASSF1胎儿负荷低于SRY测定值。
ddPCR®技术还有更大的威力，更广的应用，如何利用微滴式数字PCR的特性挖掘出更多的场景，我们共同努力。
