应用分享|QX200 ddPCR定量检测水或饮料中的铜离子

一、重金属的危害

铜是在工业上应用广泛的重金属元素，也是潜在的污染物。人体如果摄入过量的铜将导致不可逆的肝脏、肾脏损伤；另外，痕量的铜仍然可与饮食中的胆固醇互作，产生神经毒性。总而言之，重金属Cu²⁺的定量检测对于环境水体及饮用水污染风险评估来说意义重大。 

二、传统检测方法局限

科学家发现，在结合了Cu²⁺后，一种特殊的核酸序列能导致DNA链的断裂，这为Cu²⁺的检测提供了一个基于生物传感器的敏感而特异的检测手段。然而，已有的方法由于没有信号放大的步骤，检测灵敏度达不到实际应用的水平；另一方面如果使用分光光度计或qPCR仪检测荧光信号，也只能实现定性检测，无法用于判断Cu²⁺浓度是否超过临界值。因此，若要以生物传感器的方式来检测铜离子，信号放大和定量检测是必须的。

三、新方法—生物传感器与ddPCR相结合

中国农业大学的研究团队建立了基于Bio-Rad ddPCR系统和脱氧核酸酶生物传感器的方法，利用生物传感器的核酸信号转移及ddPCR的绝对定量能力，实现对重金属Cu²⁺的定量检测，LoQ低至 0.5 pmol，LoD达到 50 fmol至 10 fmol。

四、方法原理及步骤

该方法包括生物传感器和ddPCR检测两个步骤组成。

步骤1：研究人员设计合成了一段单链DNA序列作为核酸酶(DNAzyme)→单链靶DNA序列(底物)含有引物配对区域和剪切位点→ 在适宜的温度下，当存在Cu²⁺时，作为DNAzyme的DNA单链与底物单链杂交，并从特定的位点切割底物序列(Figure a)。

结果：第一个步骤的产物包含三种单链，即DNAzyme、断裂的底物和未被切割的底物(Figure 2)。

步骤2：三种单链DNA会随机分装进不同的油包水微滴中→只有未被切割的底物序列才能通过PCR扩增使其所在微滴呈现较强的荧光→包裹DNAzyme序列或断裂底物序列的微滴为阴性。

结果：通过ddPCR对待测样本中底物序列拷贝数A和阴性对照中的底物拷贝数B进行绝对定量，即可计算切割比率R=(B-A)/481.6

五、方法的可行性

1.研究人员还通过圆二色光谱测定了Cu²⁺与DNAzyme的结合模式，发现一分子DNAzyme结合1个的Cu²⁺。

2.在 0.5 pmol— 50 pmol(三个数量级)的范围内，切割比例与铜离子含量间有极好的线性关系(R2=0.9972)，满足绝大多数实际样本中Cu²⁺离子的准备定量检测。

3.研究人员还测试了Ag⁺ , Ca²⁺ , Mg²⁺ , Ba²⁺ 和Fe³⁺ 离子的干扰，证明基于ddPCR的Cu²⁺检测方法具有良好的特异性。

六、方法实用性

通过对天然水、雪碧饮料样本的实测，本方法显示出很好的实用性，为环境监测及食品安全领域中超低含量Cu²⁺离子的定量提供了新的技术手段。