食物中如果存在产志贺毒素型大肠杆菌（ShingaToxin-producingEscherichiacoli,STEC），可能会引起一系列人类消化道疾病，威胁人类健康。其中的一类亚群为肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhageE.coli，EHEC），可造成更严重的疾病如出血性腹泻、溶血尿毒综合征、肾衰竭和微血管性溶血性贫血等，严重时可致命。因此对EHEC的检测在食品安全检验工作中非常重要。从生化特征上很难将EHEC和其他可共生的大肠杆菌或较为无害的STEC区分开来，但在基因分子标志物上是有区别的，大多EHEC菌系都同时含有志贺毒力基因stx1或stx2，以及编码紧密黏附素的基因eae。目前经典的检测方法是将样品经选择性培养后，用基于PCR的方法检测以上这几个基因。挑战在于如果样品中的stx和eae基因分别存在于不同的细胞中，则会导致结果出现假阳性，由此法检测报告为EHEC阳性的经后续验证有约50%为假阳性。为了克服这个问题，来自加拿大食品检验局和卡尔顿大学的科学家们携手，利用微滴式数字PCR（dropletdigitalPCR，ddPCR）技术中微滴包裹完整单个细菌以及分析stx和eae基因同时出现的连锁性（linkage），轻松区分真假阳性结果。科学家们给这种创新的方法起了个很艺术的名字——MuSICddPCR(MultiplexedSingleIntactCelldropletdigitalPCR)[1]。
▶实验设计：
针对目标标志基因stx1、stx2各设计一组特异性引物探针（FAM标记），针对基因eae设计另一组特异性引物探针（类似于HEX的标记）。ddPCR技术中产生纳升级微滴可以包裹整个细菌，其后通过加热裂解将细菌中的核酸释放进入ddPCR反应体系，与以上assay发生反应。如果是含EHEC的阳性样本，stx和eae双阳的检出概率大；而如果是有eae-阴性的STEC和eae-阳性的E.coli组成的阴性混合型样本，stx和eae双阳的检出概率小，两者间有明显差别（见下图）。QuantaSoft软件能方便而直接地计算出linkage值，即stx和eae基因相连锁（而非随机分配在一起）的片段浓度值，再用拷贝数相对稳定的eae基因浓度值做校正，就能得到两个基因相连锁的百分比（percentlinkage），以此作为区分阳性和阴性样本的依据。
▶材料与方法：
文章中共选用了40种不同的E.coli品系，包括19个stx、eae基因双阳的EHEC品系，16个仅含stx基因的STEC品系，1个仅含eae基因的E.coli品系OLC0684，1个stx、eae基因均不含的品系OLC1543作为阴参，1个含有stx、eae基因片段相连质粒的品系OLC2283作为阳参。
在用qPCR的方法验证完所设计的assay有效性后，后续的实验结果基本都是基于ddPCR得到的。每个ddPCR体系中控制上样量：目的细胞约500个，或25pggDNA，或25fg质粒DNA。体系中还整合了BamHI内切酶对模板进行酶切，因为发现其对stx基因的反应效率有利。具体实验体系和条件请参见原文[1]。
实验内容主要包括：
1.比较分别用完整细菌细胞和提取的基因组DNA上样做ddPCR的实验效果；
2.用细胞系评估MuSICddPCR区分EHEC和阴性混合样本（eae-阴性的STEC+eae-阳性的E.coli）的能力；
3.评估MuSICddPCR是否可以在模拟的富集培养基以及真实的食物来源培养基中发挥鉴定EHEC的功效。
▶实验结果：
1.使用gDNA（下图左）和完整细菌细胞（下图右）上样的结果比较——从微滴散点图分散程度可见，使用较为纯净的gDNA直接作为模板时两个靶标基因的反应效率要优于以完整细胞上样的情形，毕竟细胞裂解物中大多属于PCR反应抑制剂。但细胞上样的结果总体还可以分清阴阳性微滴的界限，可用于后续分析。
虽然用gDNA和完整细胞上样时结果中均呈现双阳性微滴，但是否由基因连锁或是随机分配于一起所致还不得而知。这里就得依靠QuantaSoft软件提供的linkage值和eae基因浓度值来计算连锁百分比了。如下图所示，阴参结果正常，阳参中由于采用stx、eae基因片段相连质粒为模板，结果与以细胞上样的连锁百分比一致。其余所用EHEC品系中，以gDNA和完整细胞上样的连锁百分比有着明显区别（<0.8%vs.>31.8%）。因为stx、eae基因在细菌基因组中间距超过1Mb，核酸提取过程中很容易在其间打断，所以结果中观测到的连锁性极低。这也解释了为何本文一定要用完整细胞进行上样的原因。
2.区分EHEC和阴性混合样本（eae-阴性的STEC+eae-阳性的E.coli）结果——见下图，使用MuSICddPCR方法可以方便而清晰地分辨出stx、eae基因连锁百分比值高（>39%）的EHEC品系和连锁百分比值低（<1.99%）的阴性混合样本品系。
3.在模拟的富集培养基中鉴定EHEC的结果——实际鉴定所用的富集培养基中会存在高浓度的背景无关细菌干扰，MuSICddPCR是否还可以鉴定出基因连锁百分比较高的EHEC品系的存在？这里模拟了该情形的发生，科学家们将EHEC品系OLC0464、OLC0710和OLC0797，以及阴性混合样本（OLC1335+OLC0684、OLC1535+OLC0684）分别与背景E.coli按1:10、1:100、1:1000和1:10000比例混合进行实验。结果3个EHEC品系和2个阴性混合样本间依然有明显的区分（stx、eae基因连锁百分比>50%vs.<0.15%），且即使在各种浓度背景细菌干扰下，连锁百分比值也和纯品系时一致（下图）。体现了MuSICddPCR强耐受干扰和定量精准的特点。
在真实的食物来源培养基中鉴定EHEC的结果——难度再次升级，在各类真实的食物来源培养基中除了有多种微生物的干扰，还有多种反应抑制剂的存在，MuSIC ddPCR是否依然有效？将4个EHEC品系培养液与4种不同的食物来源富集培养基分别按1:100、1:1000体积混合，2个阴性混合品系培养液与食物培养基按1:10体积混合，检测结果见下图（*代表数据缺失）。1:1000 EHEC样本中stx、eae基因连锁百分比均>23%，1：100 EHEC样本中连锁百分比>46%，而阴性混合样本中该值<0.45%，依然可以区分阴阳性品系。
至此文章成功证明了MuSICddPCR方法可以实际应用于食品安全检测中的EHEC鉴定。相比于其他方法，此法快速简便，通量较高，重复性好，耐受干扰能力强，可有效排除假阳性鉴定结果，从而省去后续大量验证工作。
