“心怀梦想，走近Nature”系列三——困扰已久的细胞自发荧光总算有了科学的解答！

由于荧光细胞结构组分和代谢物的存在，原核和真核细胞表现出固有的自发荧光。因此，作者预期细胞自发荧光（AF）随细胞的代谢状态而变化，研究了不同应激源的暴露如何改变大肠杆菌细胞的AF。他们观察到杀菌处理增加了绿色AF，并且观察到的AF增加需要从头蛋白质合成。激发和发射光谱以及来自黄素生物合成途径的基因表达的增加强烈暗示黄素是增加AF的主要贡献者。编码参与能量产生和ROS解毒的各种黄素蛋白的基因表达增加，表明这是一种应对严重应激的细胞策略。在应激下观察到的AF增加是一种进化保守现象，因为它不仅发生在来自不同细菌物种的细胞中，而且也发生在酵母和人类细胞中。

所有原核和真核细胞都表现出内在的自发荧光，因为存在不同的荧光细胞结构成分和代谢物，如黄素，烟酰胺 - 腺嘌呤二核苷酸，芳香族氨基酸，脂质过氧化物，晚期糖基化终产物和胶原蛋白。细胞AF光谱包含大部分光谱范围。例如，当在适当波长下激发时，黄素，NAD和脂褐素分别发出绿光，蓝光和橙光。由于这个原因，AF经常与用于研究目的的外源荧光团的光谱重叠，因此干扰荧光分析，这种现象被称为背景荧光，噪声或光谱串扰。

然而，细胞AF本身具有几个优点可用于各种分析。首先，可以监测细胞AF，而不需要涉及外部荧光团，避免了样品和使用者的潜在化学毒性，以及非特异性结合和对生物分子功能的干扰。其次，可以原位检查AF而不破坏细菌生物膜和多细胞真核组织等复杂结构。第三，由于细胞AF随细胞形态以及细胞的代谢和病理状态而变化，因此可用于诊断目的。例如，组织AF的变化用于非侵入性体内肿瘤的检测。通过测量HeLa细胞的AF变化来监测肠出血性大肠杆菌对人HeLa细胞的感染。 AF也被用作秀丽隐杆线虫线虫衰老的可靠生物标志物。 AF还可用于快速检测和鉴定食品中的细菌污染物，因为不同的细菌菌株和物种具有不同的固有荧光。

在这项研究中，作者研究了大肠杆菌细胞的AF如何随着暴露于不同应激物而发生变化。作为压力源，使用的抗生素除了具有医学重要性外，还是解决细菌生理学复杂性的强大工具。作者使用了两类抗生素：β-内酰胺类细胞壁合成抑制剂，蛋白质合成抑制剂四环素和庆大霉素。他们发现用β-内酰胺抗生素氨苄青霉素或次氯酸钠处理大肠杆菌显着增加细胞AF，而在蛋白质合成抑制剂处理的细胞中没有观察到显着的AF增加。数据表明，黄素是杀菌治疗诱发房颤的主要原因，而AF增加显示细胞适应性反应，以应对生命威胁压力源。最后作者证明了经过生命威胁治疗的绿色细胞AF的增加是一种进化保守现象，因为它不仅发生在来自不同细菌物种的细胞中，而且也发生在酵母和人类细胞中。

在研究过程中作者多次用到了Bio-Rad S3e流式细胞分选，先后完成了分选工作、自发荧光检测及细胞活性实验，充分体现了S3e分选和分析的能力。

取得结果如下

 1.氨苄西林诱导的自发荧光增加。

图1.氨苄青霉素处理对大肠杆菌细胞的前向光散射和自发荧光强度的影响。大肠杆菌7705035[MIC=4mg/L;（a）和（b）]和8812112[MIC=64mg/L;（c）和（d）]用一系列氨苄青霉素浓度处理细胞3小时的指数生长。在1,2和3小时后测量处理细胞和未处理对照的自发荧光和前向光散射信号（FSC）。

2.蛋白质合成是自发荧光增加的先决条件。  

 图2.四环素处理对大肠杆菌细胞自发荧光，蛋白质合成和活力的影响。用一系列四环素浓度处理大肠杆菌7705035细胞3小时的指数生长。该菌株的MIC为1mg / L的四环素。使用AF633H（b）和TOPRO-3（c）染料和流式细胞仪评估自发荧光（a）和细胞活力。作为死细胞染色的对照，通过在65℃温育30分钟来杀死细胞。使用lacZ（d）和cspA（e）启动子评估四环素对蛋白质合成的影响，所述启动子与编码快速折叠绿色荧光蛋白（GFP）的基因融合。已知cspA由蛋白质合成抑制抗生素诱导，而lacZ应被抑制。携带具有这些报告基因融合体的质粒的指数生长的大肠杆菌细胞以及无启动子的对照质粒与IPTG和一系列四环素浓度一起温育3小时。通过减去无启动子的自发荧光去除背景自发荧光。用流式细胞仪监测每个细胞的GFP荧光和FSC，并通过FSC标准化细胞自发荧光或GFP荧光。值表示三次独立实验的中值的平均值（+/-标准误差）。

3.黄素是自发荧光增加的主要原因。