➤ 摘 要
精准的单个细胞分离对单细胞分析技术来说是必须的。这里我们通过一个简单的工作流程论证了Bio-Rad S3e流式细胞分选仪在分选单个细胞时的可靠性，分选得到单个细胞的精度可以达到94%以上，分选得到单个微球的精度可以达到100%。
➤ 简 介
源于基因随机表达的细胞异质性导致了很难解释细胞和细胞之间的在转录和翻译水平的差异，所以在单细胞层面检查基因组、表观基因组和转录组显得尤为重要。流式细胞术可以实现单细胞的分选，使得研究者可以在单细胞水平分析基因表达，转录测序和细胞成像。这篇文章中，我们展示了一种单细胞研究方法：以ZOE荧光细胞成像仪确认单细胞分选精度作为必要的质控步骤，证明S3e细胞分选仪可以可靠的将单个细胞分到8联排平底培养条里。
➤ 材 料 和 方 法
准备分选用的Jurkat细胞和微球
Jurkat细胞用含10% FBS的RPMI培养基培养，每2-3天传代。在分选前，细胞用分选溶液（含3% FBS的PBS）洗2遍，用TC20自动细胞计数仪计数，将细胞终浓度调整至2*106/ml。未染色的空白细胞用40um的过滤器过滤后上流式分选仪，调节合适电压，找到正确的设门位置。目标细胞用1*CytoTrack Green 511/525 Dye（Bio-Rad #1351203）室温避光染色15分钟，1000g离心5分钟，弃上清，用3ml分选溶液洗涤一遍，再次离心，将细胞重悬于1ml新鲜的分选溶液里，用40um的过滤器过滤后上流式分选仪。微球分选实验，取15um微球（Thermo Fisher #F13838）30ul加到500ul PBS。
S3e 细胞分选仪和细胞分选设置
S3e 细胞分选仪配置蓝（488nm）和红（640nm）两根激光，液滴延迟精准计算由ProLine校准微球实现。调节分选角度确保分选细胞落入8联排平底板条的中央。
S3e 流式分选仪实现单细胞分选并用ZOE荧光成像仪确认
在8联排收集平底板条每孔的中央的加入1ul 矿物油（Sigma，#M3516）。这些少量的矿物油可以将分选下来的细胞或微球维持在一个有限的区域里，便于观察和确认单细胞。但是这个方法不推荐用于其他分选应用。为了避免样本蒸发，分选完成后加上盖子。然后用ZOE观察，用明场和绿色荧光通道观察细胞，用明场观察微球。
➤ 结 果
优化偏转角度对于分选精度是至关重要的。偏转角度确保了分选细胞能够落入8联排平底培养条孔的正中央位置，从而也提高了回收率。左右两边的电荷以1%幅度调节调制较佳偏转角度（如图1），且左右两边的分选精度是一致的。
分选单个细胞的精度用染CytoTrack Green 511/525Jurkat的细胞来验证，分选单个beads的精度用15um的微球来确定，用ZOE来观察的结果见图2。细胞和微球个分到了13个8联排，共104个孔。其中细胞有98 个孔是单个的，其余孔是没有荧光的或细胞碎片，精度达到94%；微球有104个孔全部是单个的，精度达到100%。
图1. 偏转角度优化
图2 用ZOE荧光成像仪验证单个细胞和单个微球。单个Jurkat细胞（A）和单个微球（B）。
➤ 结 论
我们建立了一个简单的工作流程（图3）来说明S3e细胞分选仪分选单个细胞到8联排平底培养条，并用ZOE荧光成像仪来验证单个细胞分选的精度。没有一个孔包含一个以上细胞或微球。
图3. S3e单细胞分选工作流程
参考资料：
Raj A1, van Oudenaarden A, Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 2008 Oct 17;135(2):216-26. doi: 10.1016/j.cell.2008.09.050.
Bio-Rad、ZOE、TC20、CytoTrack、ProLine 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。
