对于RNA样本检测分析，通常需要先进行RNA反转录（RT）合成cDNA。在推出伊始，对于RNA的分析，微滴式数字PCR（ddPCR）也需要先RT，然后再以cDNA为模板，进行微滴生成等后续操作，即RNA反转录和ddPCR实验分两大步骤。
然而，上述两大环节却可以一步完成，没错，RNA反转录在小小的微滴里面进行，即One-stepRT-ddPCR。
先来看看下面三份应用报道
DetectionandQuantificationofBCR-ABL1FusionTranscriptsbyDropletDigitalPCR
LawrenceJ.Jennings,DavidGeorge,JuliannCzech,MinYu,andLorenJoseph
TheJournalofMolecularDiagnostics,March，2014
DIO:10.1016/j.jmoldx.2013.10.007
概要：已有研究证实了对慢性粒细胞白血病(CML)患者进行BCR-ABL1融合基因转录水平定量的临床意义。然而，由于RT-qPCR技术的检测下限（LOD）无法满足对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)有良好反应的CML患者进行疗效监控和用药指导的需要。该研究通过设计BCR-ABL1融合基因和BCR基因引物探针，采用RT-ddPCR技术检测分析每个样本中BCR-ABL1/BCR的比例，再计算出%IS值，来确定治疗效果（完全分子反应或其他）。RT-ddPCR技术数据显示出优秀线性、准确度和精确度，灵敏度低至0.001％。
DevelopmentandapplicationofareversetranscriptasedropletdigitalPCR(RT-ddPCR)forsensitiveandrapiddetectionofJapaneseencephalitisvirus
XulongWu,HuaLin,ShijieChen,LuXiao,MiaoYang,WeiAn,YinWang,XuepingYao,ZexiaoYang
JournalofVirologicalmetrods,Jun9,2017
DOI:10.1016/j.jviromet.2017.06.015
概要：日本脑炎/乙型脑炎是由日本脑炎病毒（JEV）/乙型脑炎病毒引起的，经蚊子传播的中枢神经系统急性传染病，是一种人畜共患病。实验室通常采用血清或脑脊液为样本来检测病毒特异性抗体来反映病毒含量。但如果要在防治工作中贯彻“早发现、早治疗”的原则就需要一种快速、灵敏的病毒检测方法。来自四川农业大学联合四川省出入境检验检疫局的的研究工作者分别采用RT-qPCR和RT-ddPCR两种技术对103例猪样本（包括内脏组织，脑脊液，流产物，精液和血液等）进行了JEV定量。经分析表明RT-ddPCR在灵敏度方面比RT-qPCR技术高出逾100倍，且可快速提供准确的结果。可实现对猪舍生殖衰竭疾病的快速检测，有利于保障公共卫生安全。
Characterizationofoseltamivir-resistantinfluenzaviruspopulationsinimmunosuppressedpatientsusingdigital-dropletPCR:ComparisonwithqPCRandnextgenerationsequencinganalysis
MaximePichon,AlexandreGaymard,LaurenceJosset,MartineValette,GillesMillat,BrunoLina,VanessaEscuret
AntiviralResearch,Jul31,2017
DOI:10.1016/j.antiviral.2017.07.021
概要：奥司他韦（又名“达菲”）是一种神经氨酸酶抑制剂。被美国FDA和中国NMPA等批准用于预防和治疗流感，然而神经氨酸酶H275Y(H275Y-NA）变异会使感染H1N1病毒的患者获得奥司他韦耐药性，因此需要在这类免疫抑制患者中监测H275Y变异含量。本研究旨在比较RT-qPCR、RT-ddPCR和NGS技术在突变定量方面的性能表现。首先采用已知浓度的275H（WT）和275Y（MUT）RNA按照不同比例混合成13份样本，通过对比三种平台的检测结果，发现RT-ddPCR技术检测结果准确性更高；然后针对两例临床上具有免疫抑制的患者（已故），取得奥司他韦治疗期间不同时间点的样本，采用上述三种技术进行H275Y变异检测，以NGS结果作为参照（测序深度>100X）。结果发现RT-ddPCR的表现优于RT-qPCR技术，并提示ddPCR技术可作为病毒耐药性管理——测序技术的一种替代方法。当然，作者最后表示针对H275Y-NA情况，只有在出现新的治疗方案后，ddPCR技术在对流感患者全程管理方面的优势才能更好凸显出来。
以上三份报道的共同之处就是使用了一步法试剂盒——One-StepRT-ddPCRAdvancedKitforProbes，可一步完成RNA样本的反转录及ddPCR实验过程。小编想说，其实该试剂盒早在QX100时代就已推出了，旨在高效、特异、灵敏地定量RNA靶标。
采用RT-ddPCR for Probes一步法试剂盒，线性好、灵敏度高。A. EEF2基因，B. GAPDH基因，RNA样本经2倍梯度稀释（5ng-310fg/20μl），QX100系统检测，每个梯度设置6个重复样本，结果显示重复性、线性均好；灵敏度低至1 copy/μl。数据来自Bio-Rad Bulletin 6250。
