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dPCR MIQE是如何指导实验的？（一）








提起PCR，在生物及其相关行业内可谓如雷贯耳，无人不知无人不晓，其影响之深，应用之广可见一斑。实时荧光定量PCR目前已经成为快速、精确定量核酸的权威性方法之一，与实时荧光定量PCR相比数字PCR的重复性更高、受抑制的影响更小。数字PCR由于其优越的绝对定量技术，也正在蓬勃发展，涉及包括农业、环境、工业和医学研究等多个领域。为了帮助科学家能产生一致的、高质量的实验数据， Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments（dMIQE）指南应运而生。



该指南正被全世界越来越多的研究人员、生物期刊、学术和商业机构支持。dPCR MIQE指南是一个全球标准化的成功案例，该指南规定了实验和发表文章时所必须的最低实验信息，规范了整个实验流程，以确保实验的实用性、准确性和可重复性。


实验数据无法重复？结果质量无法评估？因信息缺失被拒稿？下面我们一起来了解一下dMIQE清单是从哪些方面去确保实验结果质量的：







dMIQE清单


检查项目

重要性

 实验设计


_

定义实验组和对照组

E

对每个试验组进行编号

E

该实验实在中心实验室还是PI实验室进行？

D

 样本


_

描述

E

样本处理体积或质量

E

显微切割还是宏观切割？

E

处理程序

E

如果冰冻：状态如何，是如何快速处理的？

E

如果固定：用什么固定，是如何快速处理的？

E

样本储存条件和时间 [特别是福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）样品]

E

 核酸提取


_

定量-仪器/方法

E

储存条件：温度、浓度、时间、缓冲液

E

DNA/RNA定量

E

质量/完整性-仪器/方法；例如RIN/RQI和轨迹或 3‘：5’

E

模板结构信息

E

模板修饰（酶解、超声、预扩增等）

E

模板处理（初始加热或化学变性）

E

抑制剂稀释或标记

E

RNA样品的DNA污染评估

E

进行DNaes处理的详细信息

E

所用试剂的制造商和目录号

D

核酸储存条件：温度、浓度、时间、缓冲液

E

 逆转录（如有必要）


_

cDNA制备方法+浓度

E

一步法或两步法

E

每个反应RNA的使用量

E

反应体系及反应条件

E

RT效率

D

添加RT和不添加RT条件下测得的估计拷贝数

D

所用试剂的生产厂家和目录号

D

应体积（两步逆转录反应）

D

cDNA的储存条件：温度、浓度、时间、缓冲液

D

 dPCR目标信息


_

序列登录号

E

扩增子位置

D

扩增子长度

E

特异性筛选软件（如BLAST等）

E

假基因，逆转录假基因或其他同源物？

D

序列比对

D

扩增序列二级结构和GC含量分析

D

各引物的外显子或内含子位置（如果适用）

E

在适当的情况下，针对哪些剪切体？

E

 dPCR引物


_

引物序列和/或扩增基因上下游序列

E

RT引物的数据库的ID号

D

探针序列

D

所有结合位点和修饰信息

E

引物制造商

D

纯化方法

D

 dPCR反应条件


_

反应条件

E

RNA/cDNA/DNA的反应体系和量

E

引物（探针）、Mg2+、dNTP浓度

E

聚合酶种类和浓度

E

缓冲液/试剂盒目录号和生产厂家

E

缓冲液化学组成

D

添加剂（SYBR Green、DMSO等）

E

反应管/板的制造商和产品目录号

D

热循环参数

E

反应设置

D

质量和体积稀释（手动/自动）

D

PCR反应体系总量

D

反应单元数

E

单个反应单元体积

E

测得的反应单元总体积（有效反应大小）

E

反应单元体积差异/标准偏差

D

对照组的详细设计和使用

E

dPCR仪器生产厂家

E

 dPCR验证


_

分析优化的数据

D

特异性（在测量稀有突变、病原体序列等时）

E

校准品控制的检出限

D

如果是多重分析，同单重分析比较

E

 数据分析


_

每个反应单元平均拷贝数（λ或等效值）

E

dPCR分析程序（来源、版本）

E

异常值的识别和处理

E

NTC的结果

E

作为补充数据的阳性和阴性实验结果示例

E

在适当的情况下，证明参考基因的数据和选择理由

E

在适当的情况下，对归一化方法进行描述

E

生物学重复的数量和一致性

D

技术重复的次数和阶段(RT或qPCR）

E

重复性（批内变异）

E

重现性（批间/用户/实验室等变异）

D

实验方差或置信区间

E

统计方法分析

E

使用RDML提交原始数据

D

注：E表示“必须”，D表示建议。


上述dMIQE指南由9个部分组成，共涉及83个参数，以保证dPCR实验的实用性、准确性和可重复性。这9 部分包括实验设计、样本、核酸提取、反转录、靶标基因、dPCR引物和探针、dPCR反应条件、dPCR验证和数据分析。83个参数针对dPCR结果的重要性，分为了两类：其中标记为“E”表示必须(essential)，标记为“D”表示建议(desirable)。因此研究人员使用这个使用技术指南可以产生更规范，更可比，更可知的数据。


参考文献



1、GB-T42077-2022生物技术核酸靶序列定量方法的性能评价要求qPCR法和dPCR法。

2、The Digital MIQE Guidelines Update:Minimum Information for Publication of QuantitativeDigital PCR Experiments for 2020