【科研利器】“磷酸化指挥官”激酶研究揭秘：瑞孚迪科研工具箱来了！

激酶是生物体内一类重要的磷酸转移酶，能够催化磷酸基团由高能磷酸基团供体分子(如ATP)向特定底物分子转移。激酶不但在新陈代谢、细胞信号传导、蛋白质调控、细胞传输等过程中起着关键作用，而且在临床诊断、药物研发及疾病靶向治疗等方面也发挥着重要作用。

✅人类的激酶组：包含约518种蛋白激酶和20种脂质激酶，它们在细胞信号传导通路中发挥着重要的调节作用。

✅激酶的失调：可能会导致癌症、神经退行性疾病、糖尿病等疾病。

✅临床进展：截至2024年9月，FDA已批准82种小分子蛋白激酶抑制剂上市。这些药物覆盖的蛋白激酶靶点仅代表518个蛋白激酶超家族的一小部分。

Revvity 三大激酶研究”神兵利器“🚀

1、Activity-based kinase assays（激酶活化检测）

原理：激酶能够将biotin-底物肽上的丝/苏/酪氨酸磷酸化，这时加入Eu（供体）标记的识别磷酸化位点的抗体和XL665（受体）标记的链霉亲和素，形成夹心复合物。使用320nm或340nm激光激发供体，供体会发射620nm发射光并通过FRET效应将能量转移至受体，从而产生665nm处的发射光，且该665/620nm的信号与待测物浓度成正比。

图1 HTRF技术流程

特点：低酶消耗（10ng/孔）；不限制ATP浓度；处理时间不到2小时；易于小型化至<4μl。

相关产品：高灵敏度的通用激酶检测试剂盒，已被充分验证用于200多种Ser/Thr和Tyr激酶。

图2 通用激酶检测试剂盒

原理：Eu标记的抗磷酸底物抗体与荧光基团ULight标记的底物的结合，当供体和受体分子非常接近时。在320或340nm激光激发下，来自Eu供体的能量转移到ULight受体染料上，该染料进而产生665nm的荧光信号。荧光信号强度与ULight底物磷酸化水平成正比。

图3 LANCE技术流程

特点：底物序列公开，单组分形式，底物类型更多。

图4 部分LANCE产品，详细内容见《LANCE Product List》

2、Kinase Binding assays（激酶结合检测）

原理：使用标记有与GST/6HIS/生物素标记的激酶，可与Eu供体的特异性抗标签抗体和标记有d2（受体）的红色荧光tracer（激酶底物）结合。HTRF信号(665/620)将随着tracer的加入而增加，并将根据得到的饱和结合曲线计算tracer与标记激酶的解离常数(Kd)。

图5 激酶结合检测流程

特点：专注于I、II和III型抑制剂筛选；适应具有挑战性的情况（失活酶、突变酶、变构酶）；酶特异性；用于药效学和选择性研究的动力学结合检测。

图6 部分激酶结合检测产品，详细内容见《HTRF Product List》

3、Kinase-specific assays（激酶活化toolbox试剂）

原理：用Eu穴状化合物标记的磷酸化Tyr、Ser/Thr特异性抗体作为供体以及链霉亲和素偶联的XL665/d2受体，供体和受体非常接近时产生FRET信号。

图7 激酶活化toolbox试剂工作流程

特点：磷酸化特异性抗体；灵活的ATP浓度（无限制）；易于小型化，实现高通量；与肽或全长蛋白底物的相容性；多种包装规格适用于高通量筛选；高Z'值，结果可靠且可重现。

图8 部分激酶活化工具箱试剂，详细内容见《HTRF Product List》

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