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实验技巧 | 多种样本来源的单细胞悬液制备方法

农历年伊始，大家是否还沉浸在放假状态呢？实验手感生疏没？

Move on, move on, 导师喊你快开始科（ti）研（li）工作啦

 

 

 

做过流式的小伙伴们肯定清楚，想要流式的染色结果好，必须用单细胞悬液，细胞团和细胞碎片容易堵塞进样管。根据不同样本类型可选择不同的分散细胞的方法，以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。常用的组织来源样本的制备方法有酶消化法、机械法和化学处理法，这里就不赘述了。

 

下面小编给大家总结出从腹腔、骨髓、胸腺和脾脏样本经过酶消化法、机械法或化学处理法后获得单细胞悬液的一般程序，当然，实际操作时还是得注意可能需要视情况来稍作调整。


试剂

• 磷酸盐缓冲液（BUF036A）含有1％牛血清白蛋白（PBS / BSA）

• 氯化铵裂解缓冲液：0.16M氯化铵，0.17M Tris，pH7.2

• 25µg/ ml DNAse I  PBS / BSA或5 mM EDTA


操作步骤

1. 保持细胞在冰上以减少细胞死亡（该步骤会导致细胞聚集）， 加入DNAse I或EDTA可以减少细胞聚集。采用孔径40um的细胞过滤器来去除细胞团和细胞碎片

2.  4℃，300-400g离心5min

3. 弃去上清，用10ml氯化铵裂解缓冲液重悬沉淀

4. 混匀后在4℃孵育2min，注意：切忌超时！

5.  4℃，300-400g离心5min

6. 弃去上清，用10ml预冷的PBS / BSA（4℃）重悬沉淀

7. 重复步骤5、6，最后得到10ml的PBS/BSA（4℃）细胞悬液

8. 细胞计数，可使用TC20细胞自动计数仪来进行（Bio-Rad, #1450102）

9. 细胞浓度最终调整为0.7 - 1.2×107/ml


较佳提醒

流式细胞术实验应考虑以下几点：

a、为避免非特异性结合，需要用Fc受体阻断试剂（Bio-Rad, Seroblock试剂BUF041）阻断具有FcR的细胞，如脾脏细胞；

b、使用合适的对照：同种型对 照—用于确定是否存在非特异性染色；未染色的空白对照—监测细胞是否有自发荧光；

c、多色流式细胞术实验中，需使用补偿调节管（调节荧光补偿）和FMO管（帮助识别门控边界）。

 

 

文中产品仅用于科研用途，不用于临床诊断

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