产品开发|应用ddPCR平台定量检测血浆miR-122-5p

微小核糖核酸(MicroRNA)，又简称miRNA，是一类由动物、植物、病毒基因组编码的内源性的、非蛋白编码的小RNA，一般由19-25个核苷酸构成。microRNA在生命活动的进程中起着至关重要的调控作用，例如细胞增殖、分化和凋亡。其中microRNA-122-5p(miR-122-5p)参与多种肿瘤的发生、发展过程，研究表明在胃癌和乳腺癌细胞中过表达miR-122-5p会抑制细胞的生长、侵袭和迁移，miR-122-5p主要发挥抑癌基因的作用。miR-122-5p 在黑色素瘤血清中异常高表达，提示其在黑色素瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。

美国FDA科学家Shi Q在2013年撰文深入论述了血液microRNA，尤其是miRNA -122作为肝损害生物学指标，具有显著优于传统标志物丙氨酸氨基转移酶(ALT)的临床应用前景，但也存在无标准化的定量检测方法的问题。美国FDA在2015年8月20日发布了有关生物标志物的报告，认定miRNA-122作为临床亟需(Critical Need)的急性肝毒性安全生物标志物（非临床和临床），可应用于药物肝脏毒性的证明性研究、临床剂量递增的安全性研究及药物诱发的肝损伤3种情况。

鉴于血浆mir-122-5p定量检测的重要应用前景，柏创翌自主开发了一套基于数字PCR平台的mir-122-5p检测体系。下面介绍一下整个工作流程，包括血液采集、血浆处理、冷冻储存、miRNA分离、逆转录、液滴生成、PCR扩增、荧光读取和数据分析。

首先，由专业医护人员收集5ml外周静脉血，将其放入EDTA抗凝管中。采集后，立即将血样管倒置数次，直至完全混合，4℃保存不超过2小时。常温条件下，应立即将采集的血样在室温下2500 × g离心15分钟。收集上清，并将其转移到无菌、无核酸酶的15ml锥形管中。将转移的上清在室温下10000 × g离心15分钟，进一步纯化并去除细胞碎片。将上清转移到一个新的15ml锥形管中。分离后血浆可在- 80°C下保存两年。

我们使用某款商业化的血浆提取试剂盒分离RNA。实验方案按照试剂盒说明书进行，提取结束立即进行RNA定量。

使用本公司研发设计的特异性miR-122-5p茎环引物，与某进口品牌TaqMan™ MicroRNA 逆转录试剂盒，共同将目的miRNA反转录为cDNA，实验方案按照试剂盒说明书进行。

首先以反转录得到的cDNA产物为模板，加入本公司研发设计的miR-122-5p PCR引物探针混合液，以及BCY Digital PCR Supermix(no dUTP)配制20μLPCR反应液。

然后，将配制好的20μL PCR反应液，转移至微滴发生卡(DG8 cartridge)sample孔中，再加入70μL微滴发生油(droplet generation oil)至oil孔中，利用QX200TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器制备反应微滴。每个微滴发生卡一次可同时完成8个样品的微滴制备，用时约2.5 min。

将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板中对应的反应孔中，用铝膜热封(180℃，5sec)后，于普通PCR仪上进行扩增。本实验的扩增是在Bio-Rad T100 PCR仪上完成的，温度程序见Table 1。

Check/adjust ramp rate settings to 2 ℃/sec. Use a hearted lid set to 105 ℃ and set the sample volume to 40 μl

将PCR扩增后的96孔板放入微滴式数字PCR仪的微滴分析器中，仪器自动分析每个样品的每个微滴中荧光信号，然后，由QuantaSoft完成对数据的自动处理，获得靶序列在PCR反应体系中的拷贝数浓度（单位：copies/μL）。

空白检出限：

准备10例阴性对照cel-miR-39-3p-2样本，10例NTC样本做模板，进行反转录。使用优化后的检测体系进行检测，cDNA上样量1μL。用泊松分布概率函数统计检测到假阳性微滴的累计频率（即假阳性率）。计算临床阳性判读阈值。

该检测体系空白检出限为当FAM通道≥11个阳性微滴判读阳性。此时检测体系检测阳性微滴真实性＞99%。

精密度：

阳性对照样本hsa-miR-122-5p-2样本反转录后，cDNA上样量1μL，检测10次重复，由此求出批内精密度CV（%）值9.78%，小于15%，符合预设技术指标，检测体系精密度良好。

线性灵敏度：

hsa-miR-122-5p-2样本反转录，cDNA按5倍梯度稀释，上样体积1μL，做5个浓度梯度，每个梯度5复孔。以CV值小于20%的最低稀释梯度定为该检测体系灵敏度，因此该检测体系灵敏度定为26.8拷贝。

以5个梯度作出线性回归图，以稀释度为横轴，每个稀释度的测量值均值为纵轴作出线性回归方程和相关系数平方，R2＞0.99时视为线性相关性良好。

准确度：

检测8例真实样本，反转录总体系15ul、RNA用量5ul、PCR上样量1.33ul，使用自主开发的检测体系与某进口品牌检测体系同步对比，对比检测结果。拷贝数值80%以上趋势一致，准确性良好。

ddPCR图片展示：

微滴式数字PCR(ddPCR)被称为第三代PCR技术，由于在人体例如血浆、尿液等体液中的miRNA分子丰度普遍不高，而数字PCR由于其在微量检测技术上的重大创新和突破，目前已成为液体活检中认知度最高的技术手段。柏创翌生物配备了国际一流的数字PCR技术平台：伯乐微滴式数字PCR(QX200、QX600)，希望能为客户提供优质的miRNA定量检测服务。